Оптимизация на удобни PCR машини в реално време в реално време

Ако това е количествено PCR за флуоресценция в реално време за количествено определяне на вируси и генотипиране на SNP, се нуждаем от PCR машина с възможно най-висока специфичност; Ако става въпрос за откриване на патоген и мРНК, се нуждаем от PCR машина с висока чувствителност , така че как да оптимизираме тази PCR машина?

Ето списъка със съдържание:

l Подобряване на ефективността на усилване на PCR машината

l Използване на PCR машини за PCR в реално време за общ PCR

Подобряване на ефективността на усилване на PCR машината

За да подобрим ефективността, специфичността и чувствителността на PCR машината , можем да оптимизираме количествената PCR машина за флуоресценция в реално време за експеримента чрез серия от мерки. Първият е изборът на целевата последователност.

1, Изборът на удобна PCR-целева последователност в реално време в реално време е подходяща дължина между 50 и 150bp. По -късите последователности отнемат по -малко време за синтезиране и имат по -кратки срокове на усилване, така че възможността за замърсяване на ДНК се намалява.

2, Когато избирате целевата последователност, използвайте търсене в Blast, за да анализирате целевата последователност за полиморфизми и грешки в секвенирането и да ги избягвате. Ако в целевата последователност има дублиращи последователности, това ще намали чувствителността към откриване на тази PCR машина и също трябва да се избягва.

3, контролирайте съдържанието на GC ≤ 60% в целевата последователност. Високото съдържание на GC ще повлияе на денатурирането на целевата последователност в топлинния цикъл, но също така лесно да се получи това неспецифично усилване на PCR машина.

4, избягвайте генерирането на вторична структура. Целевите последователности с обратни повтарящи се последователности са лесни за получаване на вторична структура, което влияе върху хибридизацията на удобните PCR машини и сонди в реално време в реално време.

В допълнение към това, ние също трябва да гарантираме, че качеството на шаблона няма да повлияе на усилването, резултатите от удобната PCR машина в реално време имат надеждност. Например, повредената ДНК не може да бъде амплифицирана адекватно в PCR машината или изобщо не е амплифицирана. Също така, наличието на ДНК полимераза, инхибиращи реагентите (DMSO и др.), И замърсители (SDS и др.) В шаблона може да повлияе на надеждността на резултатите от усилването на PCR машината.

Използване на PCR машини за PCR в реално време за общ PCR

Вземете удобни в реално време PCR машини за PCR , този метод може да се използва и за обикновен PCR.

1, дължината трябва да бъде 18-30bp, за да се гарантира специфичността на свързването.

2, температурата на топене (стойност на ТМ) трябва да бъде 55-60 ° С, а стойностите на ТМ на двата праймера трябва да се различават с 2-3 ° С.

3, всеки праймер трябва да има 1 до 3 гуанини или цитозини в 3 'края, което може удобно да намали неспецифичното амплификация по време на PCR машината в реално време. Повече от 3 ще предизвика обратна реакция и ще доведе до 'плъзгащ се ефект ', водещ до грешно разширение.

4. Съдържанието на GC в праймерите трябва да бъде около 50%, твърде високото съдържание на GC ще увеличи стойността на ТМ.

5, PCR машинните праймери трябва да избягват обратни повтарящи се последователности, тъй като тя ще образува вторична структура, влияеща върху свързването на праймера върху шаблона.

6, ако това е RT-PCR, също трябва да избягвате да проектирате праймери, които да се свързват с екзонни последователности, което ще доведе до фалшиво-позитивни експериментални резултати от PCR машина. Правилният подход трябва да бъде проектиран на дългия интрон на фланга или къси интрони или в региона на кръстовището на екзона.

7. Озабаждане и пречистване на праймерите.

Обърнете внимание, че понякога, когато сте направили всички точки, праймерите може да не се усилват, така че трябва да препроектирате праймерите.

Фокусирайки се върху бързото откриване на нуклеинова киселина и бързото откриване на POCT, Bioteke предлага видове лабораторни инструменти като: събиране на проби от вируси, автоматичен екстрактор на нуклеинова киселина, PCR машина и апарат за дезинфекция. И също така предоставя много видове реагенти и комплекти.